关于实验中抗体的常见问题及解决方法

边缘效应

组织边缘贴附不牢，边缘组织松脱漂浮于液体中

APES/多聚赖氨酸处理玻片；组织切片尽量薄；尽量避免选用坏死较多的组织

试剂未充分覆盖组织

滴加试剂时让试剂完整覆盖组织

非特异性染色体

抗体质量问题

使用质量有保证的抗体

抗体孵育时间长

减少孵育时间

抗体浓度过高

降低抗体浓度

一抗为多抗

使用单克隆抗体

内源性过氧化物酶及biotin

延长灭活时间

封闭不足

延长封闭时间

DAB孵育时间过久或浓度过高

按说明书配置试剂，镜下控制反应时间

抗体孵育后洗涤不充分

每次孵育之后洗3*5次

滴加试剂时干片

及时滴加试剂

切片在缓冲液中浸泡过久

抗原修复之后及时封闭加一抗，不能过夜

阴性结果

抗体浓度及质量

选择有质量保证的抗体，先做预实验摸索抗体使用浓度

抗原修复不全

摸索合适的抗原修复方式及修复时间

抗原丰度

正常阴性

封闭时间过长

减少封闭时间

DAB孵育时间短

镜下控制显色时间

细胞通透不全，抗体未能进入细胞反应

选择合适的通透剂及其反应时间

一抗二抗不匹配

选择正确来源的二抗

脱片

玻片未处理好

玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理

切片厚薄不均匀

更换刀片；调整好切片机状态

烤片时间或温度不够

60摄食度2小时

组织自身问题

肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片

抗原修复时温度迅速变化

抗原修复后让其自然冷却

操作时用力过猛

有脱片嫌疑的切片不要用力甩，用吸水纸吸干残余液体

染色弱

抗体浓度低，孵育时间短

提高抗体浓度，延长反应时间

试剂使用超过有效期

试剂定时更新

滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释

滴加试剂前尽量减少残余液体

封闭过度

减少封闭时间

着色不均匀

切片厚度不一致

更换刀片；调整好切片机状态

试剂配制未混匀使局部浓度不一致

试剂充分混匀后滴加

试剂未完整覆盖组织

滴加试剂时让试剂完整覆盖组织

脱蜡不完整

更换脱蜡剂或延长脱蜡时间