HRP标记抗体工作浓度的选择介绍

　　

　　酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

　　

　　HRP标记抗体稀释液(HRP-AntibodyDilutionBuffer)适用于免疫组织化学与免疫印迹等实验中HRP标记抗体的稀释。稀释液中添加了抗体保护剂和稳定剂等成分，有效增加了稀释后HRP标记抗体的稳定性。用此稀释液稀释后的HRP标记抗体可在2-8℃稳定保存至少六个月。

　　

　　注意事项：

　　

　　如需抗体回收再利用，建议在2-8℃进行抗体的结合反应，以减缓抗体效价的衰减速度。

　　

　　为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

　　

　　HRP标记抗体工作浓度的选择：

　　

　　在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

　　

　　1.酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。

　　

　　2.其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05MPH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2MH２SO40.05ml终止反应。

　　

　　3.结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值，并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。