HRP抗体标记的方法介绍

　　

　　辣根过氧化物酶（HRP）是一种含亚铁血红素的蛋白质，广泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子质量约为40KDa。作为酶标记抗体是通过共价键经适当的方法将酶联接在抗体上，形成酶标抗体后再通过酶对底物的特异性催化作用，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，利用肉眼、光学显微镜或电子显微镜可对结果进行观察。

　　

　　HRP由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，该酶的活性中心含铁卟啉即辅基，在403nm波长处呈现zui高吸收峰，酶蛋白部分吸收波长为275nm，纯度为二者的吸光度比值RZ，该酶与抗体标记的方法有多种，根据酶的结构可分为戊二醛两步法和过碘酸钠法两种方式标记抗体。

　　

　　HRP抗体标记的方法：

　　

　　一、戊二醛两步标记法

　　

　　戊二醛（GA）是常用的双功能基团交联剂，它的两个功能基可以与HRP和抗体上的氨基结合，形成HRP-GA-IgG结合物。在两步法中先将酶与过量的GA反应，形成二者的结合物，然后再将该结合物进一步与抗体蛋白质分子的氨基交联，形成酶标记抗体。

　　

　　二、简易过碘酸钠标记法

　　

　　利用过碘酸钠将HRP的糖基氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合形成Schiff碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。此方法只适用于含糖量较高的酶。