HRP标记抗体的操作步骤及其注意事项说明

　　

　　辣根过氧化物酶（HRP）是一种含亚铁血红素的蛋白质，广泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子质量约为40KDa。HRP作为酶标记抗体是通过共价键经适当的方法将酶联接在抗体上，形成酶标抗体后再通过酶对底物的特异性催化作用，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，利用肉眼、光学显微镜或电子显微镜可对结果进行观察。

　　

　　HRP标记抗体用纯化的待测物质抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待测物质，再与HRP标记的待测物质抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。

　　

　　操作步骤：

　　

　　1.标准品的稀释。

　　

　　2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　

　　3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　

　　4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

　　

　　5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　

　　6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　

　　7.温育：操作同3。

　　

　　8.洗涤：操作同5。

　　

　　9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

　　

　　10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

　　

　　11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

　　

　　注意事项：

　　

　　1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高，效价高（z低1∶16），纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件；

　　

　　2.所使用试剂的pH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质），否则影响标记效果；

　　

　　3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，需认真检查防止漏液；

　　

　　4.浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。